01 實驗介紹

明暗箱實驗也叫光/暗轉(zhuǎn)換測試 (LDT) ，是用于測量小鼠焦慮樣行為的*泛使用的測試之一。該測試基于小鼠對明亮區(qū)域的自然厭惡以及它們對輕度壓力源（例如新環(huán)境和光線）的自發(fā)探索行為。該測試對抗焦慮藥物治療也很敏感。測試裝置由一個盒子組成，盒子分為一個小（三分之一）暗室和一個大（三分之二）明亮的照明室。將小鼠放入照明的隔間中，并允許在兩個室之間自由移動。進入暗室的第一個潛伏期和在亮室中花費的總時間是小鼠明亮空間焦慮的指標(biāo)。由于隨著時間的推移習(xí)慣化，轉(zhuǎn)換是活動探索的指標(biāo)。LDT 快速且易于使用，無需事先對動物進行培訓(xùn)。在這里，我們提出了我們的協(xié)議，該協(xié)議能夠檢測小鼠的抗焦慮樣（減少焦慮）和類焦慮（增加焦慮）行為。02 材料和試劑

1. 紙巾
   

2. 實驗室飼養(yǎng)的小鼠
   關(guān)鍵注意點：小鼠在每籠 3-5 組中飼養(yǎng)，在 12 小時光照/黑暗循環(huán)（上午 7:00 開燈）下保持在溫度（~23°C）和濕度可控的房間內(nèi)，隨意獲得食物和水。
   

3. 70% 乙醇

03 實驗設(shè)備

1. 用于明暗箱測試的設(shè)備由一個盒子（42 x 21 x 25 厘米）組成，盒子分為一個小（三分之一）暗室和一個大（三分之二）照明室。一個 3 厘米高、4 厘米寬的受限開口連接兩個腔室（如圖）。
   

2. 間接白光源
   

3. 數(shù)字照度計
   

4. 攝像機（直接放置在設(shè)備上方）
   

5. 用于手動分析的數(shù)字計時器或用于自動分析的計算機

04 動物行為分析軟件

• VisuTrack

• 1.系統(tǒng)擁有多種識別算法：智能識別法、灰度法、靜態(tài)背景法、動態(tài)背景法以及高斯背景法，可自動識別動物的活動狀態(tài)及睡眠狀態(tài)，并可生成可視化的矢量圖、運動軌跡圖、熱圖（2D、3D）以及活動量圖（2D、3D）等；

2.系統(tǒng)擁有完善的外部輸入輸出控制，將行為與生物信號（腦電圖、血壓、神經(jīng)元活動、超聲波發(fā)聲）和實驗刺激（聲音、光、電擊等）整合；
3.軟件對動物形體進行全局分析，以檢測鼻尖（Nose position）、前部軀體中心（Forebody Center）、身體中心（Animal Center）和尾根（Tail Base position）四個特征點，并據(jù)此分析動物行為；
4.系統(tǒng)可以全自動分析更多實驗動物的精細行為, 如爬行/靜止/原地微動,擺頭/甩頭,理毛修飾,轉(zhuǎn)圈,支撐站立,靠邊行走，嗅探，伸長，身體彎曲等，并可以生成相應(yīng)時間內(nèi)的動物行為圖譜及節(jié)律時序圖；
5.系統(tǒng)包含了GLP模塊（GLP Module），可以實現(xiàn)用戶權(quán)限、用戶策略分配，系統(tǒng)自帶管理員模式、審閱用戶模式以及實驗員模式，對應(yīng)有不同的軟件使用權(quán)限，并可以導(dǎo)出符合GLP要求的操作日志表以及審閱日志表，同時可以開展動物行為“雙盲"實驗；
6.同一套軟件可以在同一臺電腦上同一時刻在線或離線分析不同的動物行為實驗，提高實驗效率的同時更增加了藥效評價的可靠性、實時性以及同步性，且分析結(jié)束后數(shù)據(jù)會自動按照實驗類別歸類；

05 實驗步驟protocol

1. 該設(shè)備放置在一個隔離的房間中，遠離外部干擾和噪音，使用低強度白光源。
   

2. 實驗者必須注意，不能在測試過程中發(fā)出任何過大的噪音以及佩戴氣味強烈的氣味產(chǎn)品，因為它可能對小鼠產(chǎn)生焦慮刺激。
   

3. 光照室中的照明必須為 200-400 勒克斯或更高，而另一個室則為暗室（5 勒克斯或更低）。
   

4. 實驗前將小鼠在其家籠中轉(zhuǎn)移到行為測試室至少 30 分鐘。
   

5. 用 70% 乙醇清潔設(shè)備的兩個隔間。
   

6. 打開相機并將一只老鼠放在明亮的房間中間。
   

7. 實驗者盡可能遠離盒子和測試動物的視線之外。
   

8. 允許動物在兩個腔室之間自由移動 5 分鐘。
   

9. 每次試驗后，去除所有尿液和糞便，并用 70% 乙醇清潔兩個腔室。
   

10. 錄制的視頻可以通過VisuTrack動物行為分析軟件（上海欣軟）自動分析。對以下參數(shù)進行評分（圖 2）：

• 進入暗室的潛伏時間。

• 在明箱和暗箱中分別花費的時間。

• 在明箱中的活動距離。

• 明暗箱進入的轉(zhuǎn)換次數(shù)。

06 注意事項

• LDT 最初是由 Crawley 及其同事開發(fā)的（Crawley 和 Goodwin，1980）。原始版本和我們的測試有兩個不同之處。首先，原始版本的測試持續(xù)時間為 10 分鐘，而我們只使用了 5 分鐘的測試時間。其次，在原始版本中，照明隔間的墻壁是透明的，而我們使用不透明的白色塑料作為墻壁。因此，與原始版本相比，我們的改進更具體地檢測明亮空間焦慮，其中也對開放空間焦慮進行評分。
  

• 通常，雄性小鼠用于該行為實驗，因為發(fā)情周期的變化可能會影響雌性在此類測試中的表現(xiàn)。
  

• 基線活動可能因小鼠品系和年齡而異。
  

• 為了保證均勻的光度，使用間接光來避免陰影的產(chǎn)生，這可以成為動物的選擇。
  

• 在對每只動物進行測試后，必須始終清潔兩個隔間，并在清潔后*干燥，因為清潔劑的強烈氣味可能會改變小鼠的行為。
  

• 僅當(dāng)動物將 2 個前爪和一半身體進入其中時，才考慮進入明亮或黑暗的隔間。如果動物用這兩只爪子返回隔間，則不記錄進入。VisuTrack軟件有單獨的設(shè)置動物進入?yún)^(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)（可自定義）。